上次荷叶介绍了给常规研究套路加个“高大上”的理论假说来升华文章的档次，但是很多时候没有这种理论假说怎么办呢？今天荷叶借一篇研究肿瘤内T细胞的文章一窥其研究套路的升华。
文章梗概：肿瘤抗原特异的CD8+T细胞是杀伤肿瘤的主力细胞群，但是肿瘤中的CD8+T细胞常常“发挥失常”。
Ying Zhang等通过研究了在肿瘤微环境中黑色素瘤抗原特异的CD8+T细胞的变化，发现在低氧、低糖的肿瘤微环境中CD8+T细胞利用脂肪酸分解代谢供能，维持CD8+T细胞杀伤能力；同时他们还发现促进脂肪酸代谢的PPAR激动剂能够与PD-1抗体相互协同抑制肿瘤生长。研究成果发表在2017年9月的《Cancer Cell》上。
常规研究套路
第一步，获得肿瘤抗原特异的TILs。
1）以黑色素瘤细胞系B16BrafV600E皮下荷瘤3天后，利用腺病毒系统表达黑色素瘤特异的抗原表位MAA（Trp-1455-463）和E7免疫小鼠；
2）利用OT-1转基因小鼠（表达OVA抗原表位），皮下接种B16OVA（表达OVA的B16细胞）。研究发现以肿瘤疫苗免疫的小鼠肿瘤生长缓慢。
第二步，观察、检测随着肿瘤进展肿瘤特异CD8+TILs的变化。作者从细胞数目、功能和形态等方面展开研究。
研究发现随着肿瘤进展，CD8+TILs细胞数目逐渐减少，同时PD-1和LAG-3免疫检查点表达水平逐渐升高。对CD8+TIL的功能研究发现，其颗粒酶GrmB、IFNr和穿孔素Perforin表达水平下降。
作者进一步研究发现随着肿瘤进展CD8+TILs的线粒体膜电位降低，而线粒体ROS升高。透射电镜观察了线粒体的超微结构，发现肿瘤生长时间长的CD8+TILs的线粒体肿胀，线粒体嵴减少，这些结果提示TILs的线粒体随着荷瘤时间的延长而发生改变。
第三步，探讨在肿瘤微环境中CD8+TILs发生这些变化的原因。由于肿瘤细胞的快速增殖能力，消耗大量的氧气和葡萄糖（有氧糖酵解），因此肿瘤微环境常常是低氧、低糖的。研究发现TILs细胞HIF1α表达水平随肿瘤进展而升高，HIF1α下游分子Glut1表达亦升高，这些提示TILs随着肿瘤进展而逐渐缺氧。进一步分析血清、荷瘤14天和30天的肿瘤组织的血糖水平，发现随着肿瘤进展肿瘤内血糖逐渐降低。
为了明确HIF1α在TILs和肿瘤中的作用，作者敲低CD8+T细胞的HIF1α的表达，发现敲低HIF1α后T细胞的杀伤能力增强。T细胞过继实验在体内证实敲低HIF1α能够抑制肿瘤的生长。
研究套路之升华
很可能大多数的研究者研究到这就接近尾声了，有表型，有机制，还做了体内的挽救实验，发个7-8分的文章还是不成问题的。但是这篇文章的作者没有浅尝辄止。
第四步，作者没有局限于HIF1α，而是将HIF1α作为一个引子，换了个研究角度，从代谢的层面出发，继续深入研究低氧、低糖的肿瘤微环境中CD8+TILs发生变化的原因。作者发现敲低HIF1α后TILs的代谢发生改变：糖酵解相关酶表达下降，脂肪酸代谢相关酶升高。
作者转换研究角度，分析了CD8+T细胞低糖、低氧环境的代谢表达谱，发现葡萄糖摄取、糖酵解相关基因表达下降，而脂肪酸摄取、脂肪酸代谢相关基因表达升高。
通过同位素标记跟踪13C的去向，作者在肿瘤模型的TILs中验证表达谱实验的结果，CD8+TILs随着肿瘤进展逐渐由脂肪酸分解代谢供能。同时对人肿瘤样本的研究发现，黑色素瘤转移灶内脂肪酸的含量增高，进一步提示脂肪酸分解代谢在肿瘤进展中的作用。
第五步，TILs的脂肪酸代谢特征如何影响肿瘤呢？作者通过PPARα的激活或抑制观察脂肪酸代谢对TILs功能的影响：发现PPARα激动剂fenofibrate能促进TILs向肿瘤组织的浸润，提高CD8+T细胞的杀伤能力，抑制黑色素瘤的生长。
而PPARα敲除后TILs的功能显著下降，GrmB、IFNr和Perforin表达水平明显下降。
第六步，研究了调节代谢药物与肿瘤免疫疗法相结合疗法的可行性。作者发现肿瘤微环境能够影响TILs免疫检查点的表达水平：HIF1α与LAG-3的表达呈正相关（可能与LAG-3启动子上有HIF1α的结合区有关），PPARα与PD-1的表达呈正相关。
抑制免疫检查点抗体与代谢药物联合作用效果如何呢？研究发现PD-1抗体治疗不影响TILs的脂肪酸代谢。但是PPARα激动剂fenofibrate能够协同PD-1抗体增强肿瘤治疗的效果。
综上所述，本研究发现在低糖、低氧的肿瘤微环境中CD8+TILs激活PPARα信号和脂肪酸的分解代谢，加速脂肪酸的分解代谢（燃烧脂肪）能够协同PD-1抗体增强肿瘤治疗效果。
科研狗们，你是否有这样的经历：当我们千辛万苦终于确认了一个表型，但是深入研究分子机制的时候常常力不从心，越做方向越窄，最终围绕着某个分子打转，尽管最终发了一篇paper，但是连你自己都不很自信，“我找的这个分子是主要机制吗？”如同本篇文章，大多数人很可能就会围绕HIF1α继续研究了，其创新性就不够。但是跳出这个窠臼，从更高层面研究——从HIF1α转到脂肪酸代谢，妥妥的高分文章。
苦恼于分子机制研究的科研狗们，不甘于发个低分文章的科研狗们，换个研究角度大胆的试一试吧！
